體視顯微鏡通常是實(shí)驗(yàn)室或生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)“主力"。用戶需要花費(fèi)數(shù)小時(shí)通過(guò)目鏡來(lái)檢查、觀察、記錄或解剖樣本。仔細(xì)評(píng)估哪些相關(guān)應(yīng)用需要用到體視顯微鏡，是確保長(zhǎng)期滿意使用的關(guān)鍵所在。決策者們需要確保自己能夠*依照自己的需求來(lái)定制儀器。為幫助用戶能更好的選擇適合自己的體視鏡，本文介紹了幾個(gè)主要考慮的因素。

體視顯微鏡發(fā)展的歷史

1890年左右，美國(guó)生物學(xué)家和動(dòng)物學(xué)家Horatio S. Greenough提出了一種光學(xué)儀器的設(shè)計(jì)原理，至今仍被所有主要制造商所采用[1-3]。基于“Greenough原理"的體視顯微鏡可以提供高質(zhì)量的真實(shí)立體圖像。1950年代末，博士倫公司（Bausch & Lomb）推出了旗下一款帶有格林諾夫設(shè)計(jì)的體式顯微鏡，其中有一項(xiàng)突破性創(chuàng)新：無(wú)級(jí)（變焦）變倍[3]。幾乎所有現(xiàn)代體視顯微鏡的設(shè)計(jì)都是基于變焦系統(tǒng)。1957年，美國(guó)光學(xué)公司推出了一種立體顯微鏡，其光學(xué)原理基于望遠(yuǎn)鏡或CMO（普通主接物鏡）原理[3]。除了Greenough型外，這種體視顯微鏡由于其模塊化和高性能而很快得到所有制造商青睞。

圖1：徠卡體視顯微鏡：A) S9 Greenough系列和B-D) M205 CMO系列。

體視顯微鏡選擇前需考慮的4個(gè)問(wèn)題

體視顯微鏡可以說(shuō)是一項(xiàng)高額投資，因此選擇過(guò)程中應(yīng)當(dāng)審視奪度，認(rèn)真思考。要將顯微鏡的用途和性能發(fā)揮到j(luò)izhi，用戶應(yīng)當(dāng)考慮以下問(wèn)題：

1.用途是什么？

• 是否涉及篩查和分類(lèi)？

• 是否需要樣本操作

• 是否需要形成書(shū)面記錄？

2. 需要觀察、記錄或可視化哪些結(jié)構(gòu)？

• 高分辨率是否比長(zhǎng)工作距離或其他因素更重要？

3. 有多少不同的人員需要使用顯微鏡？他們?cè)陲@微鏡上的工作時(shí)長(zhǎng)是多少？

• 如果顯微鏡使用時(shí)間較長(zhǎng)，請(qǐng)務(wù)必考慮人體工學(xué)性的配件，因?yàn)榇祟?lèi)配件可防止出現(xiàn)重復(fù)性勞損。

• 根據(jù)不同用戶的人數(shù)，建議選用可以根據(jù)每個(gè)使用者偏好而進(jìn)行調(diào)整的顯微鏡。

4. 購(gòu)置顯微鏡的可用預(yù)算是多少？

• 模塊化解決方案看起來(lái)投資更高，但從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，其多功能性、適應(yīng)不同使用者的能力以及各種各樣的插件和配件，從而節(jié)省更多成本。

選擇顯微鏡時(shí)需考慮的5大關(guān)鍵因素

1. 變焦范圍、放大倍數(shù)、視場(chǎng)和工作距離

• 基本都在相同放大倍數(shù)下工作的使用者不需要太大的變焦范圍。

• 如果工作流程中要求進(jìn)行搜索、查找和樣本操作，就會(huì)需要從低到高可調(diào)節(jié)放大倍數(shù)的較大變焦范圍。

• 在相同放大倍數(shù)之下，可觀看到的更大或更小的視場(chǎng)主要取決于目鏡。更大的視場(chǎng)，可以讓使用者更好的對(duì)樣品進(jìn)行定向觀察。

• 更大的工作距離意味著樣本頂部和物鏡前透鏡之前的距離更大，因此在使用期間能夠更加輕松地操作樣本。

2. 景深和數(shù)值孔徑（NA）

• NA越高則分辨率越高，但景深通常會(huì)有減少。

• FusionOptics技術(shù)結(jié)合高分辨率可獲得更大的景深。

3. 光學(xué)質(zhì)量

• 平場(chǎng)光學(xué)件：校正整個(gè)物體視場(chǎng)上的圖像平整度，適用于所有應(yīng)用。

• 消色差光學(xué)件：針對(duì)于色彩重現(xiàn)不是重點(diǎn)，而主要為了評(píng)估外形特征的應(yīng)用。

• 復(fù)消色差光學(xué)件：樣品觀察時(shí)，如果對(duì)顏色要求非常高，那就需要使用高質(zhì)量的光學(xué)件以及適當(dāng)?shù)墓庠?/p>

• 透過(guò)率：對(duì)于需要觀察樣本精密細(xì)節(jié)的應(yīng)用需求，使用具有較佳透過(guò)效果的高質(zhì)量光件會(huì)更突顯優(yōu)勢(shì)性。對(duì)于要求較高的應(yīng)用如研發(fā)用途，使用高透過(guò)率的光學(xué)件會(huì)有*不同的效果

• 色彩重現(xiàn)：如果看清樣本真實(shí)顏色是個(gè)重要指標(biāo)，則應(yīng)當(dāng)使用高質(zhì)量的光學(xué)件和恰當(dāng)?shù)恼彰鳌?/p>

4. 人體工學(xué)設(shè)計(jì)

• 人體工學(xué)配件能夠讓顯微鏡工作更加輕松并加快整個(gè)工作流程。例如，通過(guò)目鏡觀察樣本時(shí)，變焦和對(duì)焦旋鈕是否可以輕松調(diào)整？

• 如果顯微鏡交由不同的用戶操作，確保可以根據(jù)每個(gè)用戶的偏好進(jìn)行調(diào)整。

5. 照明

• 最佳照明應(yīng)當(dāng)能夠均勻照亮整個(gè)視場(chǎng)，帶來(lái)理想的對(duì)比度并且準(zhǔn)確揭示樣本的真實(shí)顏色。

深度解釋5大關(guān)鍵要素

1. 總放大倍數(shù)：物鏡、變焦系數(shù)和目鏡

體視顯微鏡的總放大倍數(shù)是物鏡、變焦光學(xué)系統(tǒng)和目鏡的合并的放大倍數(shù)[4]。

物鏡擁有固定的放大倍數(shù)。儀器的變焦光學(xué)件允許在變焦系數(shù)范圍內(nèi)改變放大率。目鏡也有固定的放大倍數(shù)。

為了求出通過(guò)目鏡觀察到的物體的放大倍數(shù)，必須將物鏡、變焦光學(xué)系統(tǒng)和目鏡的放大系數(shù)相乘。

總放大倍數(shù)的公式為：MTOT VIS = MO × z × ME，式中：

MTOT VIS 為總放大倍數(shù)（VIS代表“可視"）；

MO 為物鏡放大倍數(shù)（Greenough系統(tǒng)中為1x且沒(méi)有補(bǔ)充透鏡）；

z 為變焦系數(shù)；

ME 是目鏡的放大倍數(shù)。

一般來(lái)說(shuō)，MO的數(shù)值介于0.32x和2x之間，z介于0.63x和16x之間，而ME則介于10x和40x之間。

放大倍數(shù)對(duì)視場(chǎng)的影響

觀察目鏡時(shí)會(huì)看到一個(gè)稱(chēng)為視場(chǎng)的圓形區(qū)域|4|。視場(chǎng)的直徑取決于總放大倍數(shù)。例如，10x放大倍數(shù)的目鏡視場(chǎng)直徑為23。視場(chǎng)直徑是指在物鏡1x結(jié)合放大倍數(shù)與變焦光學(xué)之下通過(guò)目鏡所觀察到的視場(chǎng)為23 mm。

2. 景深：與放大倍數(shù)及分辨率的關(guān)系

景深由數(shù)值孔徑、分辨率和放大倍數(shù)之間的關(guān)系來(lái)決定[5-7]。

為了獲得樣品最佳的觀察效果，適當(dāng)調(diào)整顯微鏡的設(shè)置可以在景深和分辨率之間獲得最佳平衡。特別是在低倍率下，通過(guò)減小數(shù)值孔徑，景深可以顯著增加。因此，根據(jù)樣品特征的大小和形狀，找到分辨率和景深的最佳平衡是一個(gè)關(guān)鍵。

FusionOptics技術(shù)的高景深和高分辨率

體視顯微鏡能夠同時(shí)獲得高分辨率和高景深的精密光學(xué)方法可由徠卡顯微系統(tǒng)得到了實(shí)現(xiàn)[8]。通過(guò)一條光路，觀察者的一只眼睛可以看到高分辨率、低景深的物體圖像。同時(shí)，通過(guò)另一條光路，另一只眼睛看到同一物體的低分辨率，高景深的圖像。人腦將兩幅獨(dú)立的圖像組合成一幅最佳的整體圖像，具有高分辨率和高景深的特點(diǎn)。

圖2：體視顯微鏡擁有兩個(gè)獨(dú)立的光束通道（1）。在FusionOptics技術(shù)幫助下，一個(gè)光束通道提供景深（2）而另一個(gè)光束通道則提供高分辨率（3）。大腦將兩張圖像融合成一張*化的空間圖像（4）。

3. 消色差或復(fù)消色差透鏡的光學(xué)質(zhì)量

色差是一種畸變，在這種畸變中，透鏡無(wú)法將所有顏色聚焦到同一個(gè)匯聚點(diǎn)[2,9]。這是因?yàn)橥哥R對(duì)不同波長(zhǎng)的光具有不同的折射率（透鏡的色散）。當(dāng)光線在遠(yuǎn)離球面透鏡中心軸的點(diǎn)射入球面透鏡表面時(shí)，其折射程度大于或小于射入靠近球面透鏡中心點(diǎn)的光線時(shí)就會(huì)發(fā)生球差。好的光學(xué)設(shè)計(jì)的目的是減少或消除色差和球差。以下透鏡可用于減少這些問(wèn)題產(chǎn)生的影響：

消色差透鏡

• 校正了2個(gè)波長(zhǎng)（紅色和綠色）并讓兩者在同一平面上聚焦。

• 可見(jiàn)光光譜范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用。

復(fù)消色差透鏡

• 校正了3個(gè)波長(zhǎng)（紅、綠、藍(lán)）并讓三者在同一平面上聚焦。

• 可見(jiàn)光光譜范圍內(nèi)高級(jí)別的應(yīng)用。

平面透鏡

• 未經(jīng)平面校正的透鏡在整個(gè)物體（視場(chǎng)）上顯示出不均勻的焦點(diǎn)。

• 建議用于需要觀察較大視場(chǎng)的應(yīng)用。

4. 工作距離會(huì)大幅影響顯微鏡使用性

工作距離是對(duì)焦時(shí)物鏡前透鏡和樣品頂部之間的距離。一般來(lái)說(shuō)，物鏡的工作距離隨著放大倍數(shù)的增加而減小。工作距離直接影響到體視顯微鏡的使用性，特別是用于檢測(cè)和質(zhì)量控制。

5. 為獲得最佳結(jié)果的人體工學(xué)設(shè)計(jì)

一般來(lái)說(shuō)，人的體型和工作習(xí)慣相當(dāng)?shù)闹匾Ｒ虼耍瑢?duì)裝備用于特定任務(wù)并搭配有特種配件和特定工作距離的顯微鏡，其高度（目鏡）不一定適合于所有用戶。如果觀察高度太低，觀察人員在工作時(shí)會(huì)被迫向前彎曲，導(dǎo)致頸部區(qū)域的肌肉緊張[10-12]。為補(bǔ)償這些高度差，建議使用可變雙目鏡筒[10]。多虧了產(chǎn)品的模塊化設(shè)計(jì)，CMO設(shè)計(jì)下的體視顯微鏡提供了許多可根據(jù)用戶體型或工作習(xí)慣來(lái)定制儀器的方法，因此是優(yōu)先的解決方案。

6. 正確照明讓一切大為不同

對(duì)于體視顯微鏡，選擇適合的照明是一大關(guān)鍵要素[13]。適當(dāng)?shù)恼彰鲗⒂兄谕ㄟ^(guò)*化的方式來(lái)對(duì)感興趣的樣本特征進(jìn)行觀察，同時(shí)有可能發(fā)現(xiàn)新的信息。對(duì)于所使用的顯微鏡和預(yù)期的應(yīng)用，請(qǐng)務(wù)必確保良好的照明效果。

• 反射照明

用于不透光、不透明的樣本。根據(jù)樣本的對(duì)比度和感興趣的細(xì)節(jié)給出了不同的解決方案和樣本的照明要求。參見(jiàn)以下參考文獻(xiàn)13 了解體視顯微鏡入射照明的一些示例。

• 透射照明

用于各種各樣的透明樣本，從生物樣本如生物模型等到聚合物和玻璃。

• 標(biāo)準(zhǔn)透射明場(chǎng)照明

用于所有類(lèi)型的透明樣本，帶來(lái)較高的對(duì)比度和充分的顏色信息。

• 傾斜透射照明

用于幾乎透明和無(wú)色的樣本；可獲得更高的對(duì)比度和樣本的視覺(jué)清晰度。

• 暗場(chǎng)照明

用于觀察樣本平坦區(qū)域上的小特征，這些特征在明場(chǎng)中不易看到。如光澤或光亮樣本上的裂紋、氣孔、細(xì)小突起等。它還可以用來(lái)觀察尺寸低于分辨率極限的樣本結(jié)構(gòu)。

• 用于清晰透明標(biāo)片的對(duì)比法

Rottermann或浮雕對(duì)比度是一種先進(jìn)的傾斜照明技術(shù)，可以將顯示出隨著亮度的不同折射率的變化。正面浮雕對(duì)比度結(jié)構(gòu)會(huì)增強(qiáng)，而反面浮雕對(duì)比度結(jié)構(gòu)會(huì)降低。正、反浮雕對(duì)比可以更容易區(qū)分細(xì)微結(jié)構(gòu)，方便于從樣本中獲取最大量的信息。

了解更多：徠卡顯微

參考文獻(xiàn)
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2. D. Goeggel, The History of Stereo Microscopy - Part II: The 18th Century - Greater Demands are Placed on Optics, Science Lab (2007) Leica Microsystems.
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