極限就是用來打破的。當阿貝提出分辨極限以后^[3]，成像科學家們就希望發展從多角度切入以突破光學衍射極限，上世紀九十年代前后涌現出多種超高分辨率顯微成像技術，將基于光學成像技術的科學研究慢慢帶進了納米尺度空間。其中，1994年Stefan Hell就發文章闡述了使用受激輻射技術來突破分辨率的理論和STED顯微鏡搭建理論^[4]，2001年便報道了使用不同形狀的受激幅射光來突破分辨率極限的STED顯微鏡^[5]。這項技術的突破給科研工作者們提供了更高維度的研究可能，獲得了2014年諾貝爾化學獎。而STED超高分辨率成像技術也開始了20年來的打怪升級，從給科學家們帶來眾多科研想法和可能性的研究成果慢慢進化成易用、穩定的成熟商業產品。我們可以看到這項技術從理想到現實、從單維度到多維度的蛻變，STED成像技術應用的領域越來越多，解決的問題越來越復雜。

STED走進市場是2007年SP5時代的TCS STED，我第一次接觸已經是幾年后的TCS STED CW了。那時候只有雙光子和氬離子激光器作為激發光的Pulsed STED和CW STED，受激輻射光好像也只有592nm的激光?，F在回頭看，那時候的技術只能做折射率適合、592nm光吸收低、標記信號極亮的、激發光為458-514nm之間的熒光樣品成像，而這時候商業化產品的guanfang宣稱分辨率只有80nm。

那時候大家試圖在百納米分辨率以內研究細胞組分的相互作用的話，只能選擇類似BD Horizon V500和Alexa 488這種極易串色的染料組合，那時候的protocol里甚至還有串色拆分的教程。但是有和無的差別，已經很震撼了，至少研究者們可以嘗試在百納米光學分辨率的空間里進行分析研究了。

2010年前后，隨著STED染料的研發、脈沖白激光的使用和受激輻射激光的選擇變多，研究者們發現使用750nm波長的激光器可以對ATTO 647N和 ATTO 655等紅外熒光染料進行更有效的光損耗，而且在592nm受激輻射光成像時由樣品或封片劑等原因造成的信號模糊也明顯減輕了。一方面研究者們可以選擇成像效果更好的紅外染料進行單色STED，也可以使用750nm和592nm受激輻射光的聯用來實現2-3個通道的STED成像了。

2016年我的身份由方法學科研工作者轉變為平臺技術人員，這時期的STED也在前一年進入了SP8平臺時代，生物用戶們發現基于SP8的STED越來越容易上手了。2014年的諾貝爾化學獎讓領域的科研工作者們了解了STED等超高分辨率顯微鏡技術，而經過十年的發展這時候基于白激光+HyD檢測器的SP8新平臺已經非常成熟，推出了很多項對生物用戶友好的商業化技術。

首先讓人印象深刻的就是Gated CW-STED (gSTED)了，gSTED 使用更低的STED激光強度達到了比CW STED更好的分辨率，同時使用基于熒光壽命的時間門控技術用戶可以輕松地去掉592nm受激幅射光帶來的一些信號損失和模糊，這時候STED的分辨率提升到現在大家熟知的50nm。gSTED技術讓生物用戶可以使用非常熟悉的EGFP、AF488、mCherry等染料或熒光蛋白進行STED成像。雖然很多常用成像探針無法將STED效果發揮到ji致，但是對于生物學家而言，他們更偏向于不必換實驗體系就能實現研究目的。這是熒光壽命技術最初在STED商業化產品中的應用，最近幾年這個領域又有很多進展，一直持續不斷給使用者們帶來驚喜。

2016年我們單位購置了第一臺受激發射耗損顯微術，型號是TCS SP8 STED 3X。這時候紅外熒光染料對應的受激幅射光已經從750nm的連續激光升級成了775nm的脈沖激光，我們發現775nm的STED成像分辨率遠高于以前的任何波長的受激幅射光，在普通生物樣品中最佳分辨率竟然可以達到30-40nm。更神奇的是775nm的受激幅射光不再有連續受激輻射激光“一掃沒"的現象（592/660nm連續激光掃過樣品一次以后很多常見熒光探針淬滅現象嚴重，俗稱“一掃沒"），我們甚至可以使用775nm的STED成像模式進行預覽來找到更合適的拍攝位置、甚至還可以進行多層Z STACK掃描、甚至還可以做點活細胞STED成像。與之對應的是，這時候受激幅射光的形狀調制也引入了新方法，除了在xy維度上可以提升分辨率，z軸維度上也可以使用3D STED技術來提高分辨率了。

至此，對普通生物用戶而言，如果使用775nm友好的紅色和紅外染料，這時的雙通道STED成像和常規共聚焦一樣簡單了；這些染料和gSTED聯用可以實現更多通道的STED成像。而最近幾年熒光染料的發展涌現了很多long stoke位移的熒光染料，比如abberior STAR 460L、abberior STAR 520L等，也可以使用775nm的脈沖激光作為受激幅射光進行3-5色的STED成像。這些成像和制樣技術的進步使得制樣難度大大降低。而同一時期，我們也開始了從純化染色質到細菌、細胞、腦片、線蟲和完整果蠅腦等較廣泛生物樣品的STED成像^[6-9]。

雖然基于熒光壽命的STED性能提升在SP8時代已經開啟，但是真正作為獨立實用工具的推出是在2020年前后的STELLARIS平臺。在gSTED通過簡單設置hyD檢測器門控時間的基礎上，研究者們發現優化FLIM數據的分析可以進一步地提高STED的成像分辨率。在熒光光子數和分辨率平衡的基礎上，FLIM-STED達到相應的分辨率只需要使用傳統STED 1/3到1/4的損耗光強度來成像便可達到常規STED的成像效果。因此，這種TauSTED技術可以在較厚樣品成像中對z軸采集更多層的信號，也可以在活細胞成像中采集更多幀數，進一步拓寬了成像應用范圍。

與之相應的，不同STED顯微鏡廠家也改進了STED技術在厚樣品成像中應用，使用更適合生物樣品折射率的甘油物鏡、硅油物鏡或者水鏡以及特別的照明方式，讓使用者更容易對樣品較深的位置進行STED成像或者進行更厚的信號采集。2023年，有實驗室報道了使用硅油物鏡對19.3x15x6 μm3的較厚活腦片進行xyzt 4維成像，為光學成像技術在突觸分辨率水平對活體大腦組織進行動態功能研究打開了新的研究途徑^[10]。

除此之外，基于熒光壽命光譜拆分的成像方法最近二十年也一直是成像領域的研究熱點。早在2017年Hell團隊就報道了使用612 nm的激發光和 775 nm的受激幅射光對ATTO 594、Abberior STAR 635P、KK1441、CF680R標記的樣品進行STED成像并進行光譜拆分得到多通道成像結果的方法^[11]。隨著近幾年光譜向量拆分技術的成熟，使得這個方法對不同通道信號亮度的差異越來越寬容，常規生物樣品即可進行5-6色的拆分^[12]。

除了儀器的進步之外，標記技術的進步也在推動著STED成像技術在科學研究中的應用^[13]。理想的STED熒光探針應該在受激輻射成像區域內wanquan耗盡且盡量低的產生噪聲，亦不需要使用太強的受激輻射激光，從而提高STED的分辨率并減少 STED 帶來的光漂白，因此熒光探針的理化性質對STED在科學研究中的廣泛應用影響巨大。最初的STED應用中，研究者們主要篩選適合進行STED成像的傳統熒光染料或熒光蛋白，主要有BD Horizon V500、NBD-X、Alexa 488、eYFP等。

很快大家發現傳統熒光探針在實際應用中遇到一些挑戰，需要從以下幾點來開發更適合STED成像的熒光探針：

基于這些需求，研究者們開發出了STED友好的熒光蛋白 (iRFP、TagRFP657、mNeptune2、mGarnet2等)、STED友好的有機染料（Star家族、SiR等，可連接到抗體上也可以用HaloTag 或SNAPTag靶向到活細胞內的蛋白質）、避免被592nm或660nm強激光漂白的long stoke位移的熒光染料和標記物和目標區域距離更小的納米抗體等，使得STED技術更加廣泛地應用到生物研究中。

STELLARIS STED